體外細胞的原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、凍存和復蘇
更新時間：2013-06-16 瀏覽次數(shù)：2039
1.取出小鼠后瀝干酒精，放入超凈臺內(nèi)，固定在泡沫板上。
2.用鑷子提起皮膚，用解剖剪剪開皮膚一個橫切口，將皮膚向上撕開，然后剪開肌肉等，暴露出腹腔，在左側找到脾臟，用彎頭眼科鑷取出脾臟，置于無菌培養(yǎng)皿中。
4.將篩網(wǎng)置于平皿中，脾臟置于篩網(wǎng)上，用彎頭鑷鑷住，輕輕在篩網(wǎng)上進行碾磨，同時不停滴加不含血清的培養(yǎng)液沖洗。
5.將碾磨好的細胞懸液吸入至離心管中，離心（1000rpm,5min），吸去上清（去除血液等）。
6.加入10ml培養(yǎng)液，吹打混勻，取樣計數(shù)。
7.將稀釋好的細胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶中，輕輕搖晃混勻，在培養(yǎng)瓶上。
面做好標志，注明細胞、組別及日期。然后將培養(yǎng)瓶置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳代。
2.培養(yǎng)液瓶打開后，過酒精燈火焰，置酒精燈火焰周圍。
3.拿出直頭滴管，套上橡皮吸頭，過火，放入培養(yǎng)液瓶中。
4.打開培養(yǎng)瓶，瓶口過火，將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液輕輕倒入廢液缸，用2-3mLPBS洗去殘留的舊培養(yǎng)基。
7.對半貼壁培養(yǎng)細胞，不需胰酶，直接吹打，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。
1.吸取傳代后的細胞懸液，離心，去除培養(yǎng)液，加入凍存液，分裝凍存管（凍存管內(nèi)細胞數(shù)目一般為（5～10）×106個/ml，2ml凍存管中一般放1～1.5ml細胞）。
o冷凍保存方法一：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。
o冷凍保存方法二：冷凍管置于已設定程序之程序降溫機中每分鐘降1～3℃至-80℃以下，再放入液氮長期保存。
1.取出冷凍管，立即放入37℃水浴箱中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，移入無菌操作臺內(nèi)。
4.加適當培養(yǎng)液后將細胞轉移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，第二天觀察生長情況。
2.細胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁，并開始生長，如接種的細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。
3.一般情況，傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，2～4天就可在瓶內(nèi)形成單層，需要再次進行傳代。
1.取材要求新鮮，無菌，解剖小鼠時，注意不要損傷脾臟及其周圍的臟器，尤其是腸道等，防止污染脾臟。
2.沖洗脾臟時要盡量洗凈血污，去除無用組織，并要防止組織干燥。
3.碾磨后及時用清水沖洗篩網(wǎng)，防止組織、細胞阻塞網(wǎng)孔。
4.計數(shù)前，注意吸盡平皿里的細胞，充分混勻，使細胞分散成單個細胞。
5.實驗操作應在操作臺中央無菌區(qū)域內(nèi)進行，勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。
6.金屬器械不能在火焰中燒的時間過長，燒過的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組織，以免造成組織損傷。
7.另外膠塞過火焰時也不能時間長，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細胞。
8.吸取過營養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時會把有害物帶入營養(yǎng)液中。
9.不能用手觸及已消毒器皿瓶口、瓶塞內(nèi)部，吸管前部等所有可能與細胞接觸的部分，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。
10.開啟、關閉長有細胞的培養(yǎng)瓶時，火焰滅菌時間要短。防止因溫度過高燒死細胞。
11.換液時傾倒廢液，瓶口不能接觸廢液缸，速度不能過快，防止廢液四濺。
13.手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上，即不可以在開放容器上方操作。
15.注意自身的安全，對于來自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心。操作過程中，應避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑例如DMSO，并避免尖銳物品傷人等。
16.從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存，但為對數(shù)生長期細胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液。
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