DNA實驗技術：SSR標記實驗步驟
更新時間：2013-08-06 瀏覽次數(shù)：2048
一、簡介：
SSR簡單序列重復標記（Simple sequence repeat, 簡稱SSR標記），也叫微衛(wèi)星序列重復，是由一類由幾個核苷酸（1-5個）為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的重復序列，長度較短，廣泛分布在染色體上。由于重復單位的次數(shù)的不同或重復程度的不*相同，造成了SSR長度的高度變異性，由此而產(chǎn)生SSR標記或SSLP標記。雖然SSR在基因組上的位置不盡相同，但是其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以用微衛(wèi)星區(qū)域特定順序設計成對引物，通過PCR技術，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可顯示SSR位點在不同個體間的多態(tài)性。
優(yōu)點：
（1）標記數(shù)量豐富，具有較多的等位變異，廣泛分布于各條染色體上；
（2）是共顯性標記，呈孟德爾遺傳；
（3）技術重復性好，易于操作，結(jié)果可靠。
缺點：
開發(fā)此類標記需要預先得知標記兩端的序列信息，而且引物合成費用較高。
二、操作程序：
取葉片→磨樣→提取DNA→PCR擴增→電泳檢測→染色→讀帶標記。
1、DNA提取
按照Doyle和Dickson（1987）CTAB法（`Cetyl triethyl ammonium bromide）并略加改進的程序進行，具體步驟如下：
① 成熟期取葉片加液氮研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，-20℃冰箱保存；
② 加入600μl 65℃的2×CTAB混勻并置于65℃水浴中保溫30-60分鐘；
③ 取出，冷卻，上下?lián)u勻后，加入600微升24:1的氯仿異戊醇；
④ 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液于另一個1.5ml的離心管中；
⑤ 加異丙醇，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，倒掉上清液；
⑥ 干后用100%的灑精清洗，干后加適量TE。
2、PCR擴增
模板DNA的濃度大約25ng/μl,擴增反應體系為20μl。具體如下：
Sterile ddH2O 11μl
PCR Buffer 3μl
dNTP-mix 0.5μl
Primer1 1μl
Primer2 1μl
Taq polymerase 0.5ul（2U/μl）
DNA 3μl
PCR擴增程序為：（2h30min）
① 預變性：94℃，5分鐘；
② 變 性：94℃，40秒；
③ 退 火：55℃ 40秒；
④ 延 伸：72℃，1分鐘；
⑤ 循 環(huán)：從2到4共38個循環(huán)；
⑥ 72℃下zui后延伸5分鐘；4℃ 5min，擴增產(chǎn)物置于4℃的冰箱保存。
3、擴增產(chǎn)物的電泳分離
制膠→灌膠→上樣→電泳。
擴增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺變性膠電泳分離，步驟如下：
① 準備電極液（1×TBE）；
② 將梳子撥出，并迅速用電極液沖洗膠面；
③ 不預電泳；
④ 點樣，電泳220V；
⑤ 拆板，并及時將內(nèi)板、邊條及梳子洗凈。
4、凝膠染色
① 固定：10%醋酸，5分鐘；
② 染色：10分鐘；
③ 漂洗：dH2O，5-10秒；
④ 顯色：甲醛-NaOH，直到滿意為止；
⑤ 漂洗：dH2O，2分鐘。
5、自封帶封膠，讀帶標記，數(shù)碼照相攝像，室溫風干