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DNA實驗技術(shù)：變性聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗
更新時間：2013-08-22 瀏覽次數(shù)：2182
本方法由于快捷、簡便及具髙分離度，對純化寡核苷酸非常有用。盡管得到率偏低（＜50%），回收的量通常卻大大超過了大多數(shù)分子生物學(xué)應(yīng)用所需的量步驟亦可用于分離小RNA或其他單鏈多聚核苷酸。
實驗方法
- 基本方法
| 實驗材料 | 核苷酸 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 濃氨水 TBE 丙烯酰胺 亞甲雙丙烯酰胺 TEMED 尿素 過硫酸銨 TE |
| 儀器、耗材 | 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 電泳儀 |
| 實驗步驟 | 1. 用濃氨水將合成的寡核苷脧從可控孔度玻璃拄上洗脫下來。于55℃加熱5 h 以上。 2. 樣品移至離心管中，在Speedvac真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中凍干，沉淀用0.2 ml 的水重懸。 3. 裝好灌膠裝置，準(zhǔn)備合適的凝膠溶液（表1）。對于10 cm×16 cm×1.6 mm 大小的凝膠，在一個真空過濾瓶中棍合下列成分： （1）25.2 g 尿素（終濃度7 mol/l） （2）6 ml 10×TBE 電泳緩沖液 （3）40%丙烯酰胺/2%亞甲雙丙烯酰胺溶液（所需量） （4）加水至60 ml （5）脫氣10 min，加入200 μl10%的過硫酸銨及30 μl 的TEMED?；旌虾蠊嗄z，室溫下讓膠聚合30 min 以上。
表1、變性聚丙胺凝膠電泳能使相應(yīng)片段達(dá)到zui適分離度的丙烯酰胺濃度 4. 拔去梳子，將凝膠板固定在電泳槽上，用1×TBE下緩沖液注滿上層及下層槽。 5. 加樣前用2×甲酰胺加樣緩沖液將樣品作對倍稀釋。 6. 每一個2cm×1.6 mm 孔中可以加入2 μmol 合成量的25%。 7. 得到一個清哳的結(jié)果約需10 μg（50 μl 重懸樣品+50 μl 2×甲酰胺加樣緩沖液=每孔100 μl）。 8. 臨加樣前用移液器上下吹打TBE緩沖液數(shù)次以*洗滌樣品孔。 9. 加樣，在約5 V/cm2電壓降下電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)膠底部。 10. 將凝膠板從電泳槽中取出，水平放置，撬開上層板。 11. 用塑料膜覆蓋凝膠，將板翻轉(zhuǎn)，將凝膠的一角揭離玻璃板，放在塑料膜上，再用另一張塑料膜覆蓋凝膠。 12. 將凝膠放在帶熒光指示劑的薄層層析板上，用短波紫外燈跟蹤觀察條帶，條帶將在綠色背景下顯示暗跡。 13. 一個干凈的解剖刀將條帶直接切下或用墨水標(biāo)記后切出，剝?nèi)ニ芰夏?，將膠條轉(zhuǎn)移至離心管中。 14. 每2 cm 的膠條加0.5 ml 的0.3 mol/l 乙酸鈉，室溫下在旋轉(zhuǎn)揺床上洗脫。 15. 將溶液轉(zhuǎn)移至一個干凈的離心管中，不要帶入丙烯酰胺碎片。 16. 用等體積的酚抽提1次，氯仿抽提1次，乙醇沉淀，干燥，樣品用TE緩沖液或水重懸。 |
