由于巢式PCR反應有兩次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可能性（因為與兩套引物都互補的引物很少）增加了檢測的敏感性；又有兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。 由于第二套引物位于*輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片斷包含兩套引物結(jié)合位點的可能性極小，因此第二套引物不可能擴增非目的片斷。這種巢式PCR擴增確保第二輪PCR產(chǎn)物幾乎或者*沒有引物配對特異性不強造成的非特異性擴增的污染。

巢式PCR反應模式圖

基因樣品

PCR緩沖液 Tris·HCl KCl Taq聚合酶

PCR儀

1.  目標的DNA模板藍色的*對引物結(jié)合。*對引物也可能結(jié)合到其他具有相似結(jié)合位點的片段上并擴增多種產(chǎn)物。但只有一種產(chǎn)物是目的片斷（圖中未顯示可能的多種產(chǎn)物）。

2.  使用圖中紅色標記的第二套引物對*輪PCR擴增的產(chǎn)物進行第二輪PCR擴增。

*輪

1.  大?。?192 bp

2.  初始孵育：94℃4分鐘

3.  變性：94℃45秒

4.  退火：58攝氏度45秒

5.  聚合：72攝氏度45秒

6.  PCR循環(huán)：36

第二輪

1.  大?。?71 bp

2.  初始溫育：95℃2分鐘

3.  變性：95℃45秒

4.  退火：60℃下45秒

5.  聚合：72攝氏度30秒

6.  PCR循環(huán)：36

1.  引物設(shè)計原則：每個特異性引物為24~26個堿基，Tm：64-65%，GC：44-55% 。這樣你可以同時做多個不同的TAIL PCR。

2.  在*輪PCR結(jié)束之后，將PCR產(chǎn)物稀釋1 000倍（視情況而定）作為第二輪PCR的模板，第二輪PCR的產(chǎn)物同樣稀釋1 000倍（視情況而定）作為第三輪PCR的模板，這樣依次類推。實際操作中可以搞3輪甚至更多，當然做3輪是比較合適了，這個時候PCR的產(chǎn)物已經(jīng)是高度特異性了。

1.  圖解