蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白質(zhì)凝膠電泳凝膠的制備
更新時(shí)間：2013-11-27 瀏覽次數(shù)：1262
【材料與試劑】
（1）30%的丙烯酰胺：分別稱取29g 丙烯酰胺，1g N,N -亞甲雙丙烯酰胺加溫?zé)岬娜ルx子水60ml，加熱至37℃溶解，補(bǔ)加水至終體積為100ml,過(guò)濾，即配成30%（w/v）丙烯酰胺貯存溶液。丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在貯存過(guò)程中緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)楸┧岷碗p丙烯酸，這一脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化，故溶液的pH值不超過(guò)7.0，應(yīng)置于棕色瓶中4℃保存。
（2）10%十二烷基硫酸鈉（SDS）：稱取10gSDS加去離子水90ml加熱至68℃，加幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH7.2加水至100ml，即為10%（w/v）SDS。
（3）濃縮膠緩沖液（1mol/L Tris-HCl pH 6.8）：12.12g Tris溶解在80ml去離子水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8,再加去離子水至100ml。4℃保存。
（4）分離膠緩沖液（1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8）：18.16g Tris溶解在80ml去離子水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.8, 再加去離子水至100ml。4℃保存。
（5）10%過(guò)硫酸胺（AP）：過(guò)硫酸胺提供催化丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基，可用去離子水配制小量10%（W/V）貯存液并4℃保存。由于過(guò)硫酸胺會(huì)緩慢分解，故應(yīng)隔周新鮮配制。
（6）TEMED（N ， N ， N, N -四甲基乙二胺）TEMED通過(guò)催化過(guò)硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合，由于TEMED只能以游離堿的形式發(fā)揮作用，因此pH值較低時(shí)聚合反應(yīng)受到抑制。
（7）Tris-甘氨酸電泳緩沖液：分別稱取15.1g Tris 和94g甘氨酸，溶解在900 ml去離子水中，然后加入50 ml 10%（w/v）SDS，再加去離子水至1000 ml則成5?貯存液。使用時(shí)稀釋5倍，終濃度Tris為25mmol/L、甘氨酸為250mmol/L、0.1%SDS，緩沖液pH為（8.3）。
（8）聚丙烯酰胺凝膠電泳槽和電泳儀
（9）加樣器和吸頭等
【操作方法】
（1） 根據(jù)垂直電泳槽說(shuō)明書(shū)安裝玻璃板，確定需配制分離膠的濃度和體積，按“配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠所用溶液”所列成分（見(jiàn)書(shū)末附錄）配制所需分離膠；
（2） 迅速將分離膠注入兩玻璃板間隙中，留出灌注積層膠所需空間（梳子的齒長(zhǎng)再加1cm，用滴管小心地在分離膠上覆蓋一層0.1% SDS（當(dāng)丙烯酰胺濃度≤8%時(shí)）或異丁醇或水（當(dāng)丙烯酰胺濃度≥10%時(shí)），覆蓋層可防止氧擴(kuò)散進(jìn)入凝膠而抑制聚合反應(yīng)。將凝膠垂直置于室溫下；
（3） 分離膠聚合*后，倒出覆蓋層液體，用去離子水洗滌凝膠頂部數(shù)次以除去未聚合的丙烯酰胺，盡可能排除凝膠上的液體；
（4） 確定需配制濃縮膠的體積，按“配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠所用溶液”（見(jiàn)書(shū)末附錄）配制所需濃縮膠，然后直接將濃縮膠灌注在分離膠上，立即插入干凈的配套梳子，避免氣泡，然后加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙。待濃縮膠聚合后，拔出梳子，形成加樣孔；
（5） 用去離子水將Tris-甘氨酸電泳緩沖液貯存液稀釋5倍，倒入電泳槽，將加樣孔充滿，這時(shí)加樣孔中的氣泡可通過(guò)電泳緩沖液排除。