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1.  往微量滴定板的每孔中加入250 μl 含適當(dāng)抗生素的選擇性BHI培養(yǎng)液，并分別接種獨(dú)立的cDNA克隆，37℃溫育過(guò)。

2.  在250 ml 燒瓶中加入50 ml BHI/抗生素培養(yǎng)液，以10個(gè)克隆過(guò)培養(yǎng)液為一組， 從每個(gè)微孔中取100 μl 培養(yǎng)液，混合后接種到燒瓶中。

3.  37℃培養(yǎng)至A₅₉₀=0.7，然后加入氯霉素繼續(xù)于37℃溫育過(guò)；對(duì)每組10個(gè)過(guò)的克隆重復(fù)培養(yǎng)。

4.  2 000 g  4℃離心10 min，制備質(zhì)粒DNA。

 

5.  將制得的約50 μg 質(zhì)粒DNA溶于1.5 ml TE緩沖液中，移入15 ml無(wú)菌、帶蓋的玻璃培養(yǎng)管中。

6.  沸水浴10 min立即加入1.5 ml 1 mol/l NaOH，室溫放置10 min。

7.  加 9 ml 中和液，混勻后置于冰浴，檢測(cè)pH只值應(yīng)在6.5~7.5之間。

 

8.  將0.45 μm 孔徑的硝酸纖維素濾膜放在一個(gè)連于真空泵的多孔濾器上。

9.  以1 ml/min 的速率加入第4步得到的變性DNA液，待所有液體被吸干后繼續(xù)抽吸3 min。

10.  取出濾膜用50 ml 6×SSC洗滌，然后于80℃真空烤箱中烤膜2 h。

11.  用無(wú)菌的單孔打孔器在濾膜上打出直徑為5 mm 的圓形小塊濾膜，分別用圓珠筆作好標(biāo)記。

 

12.  將盛于無(wú)菌帶蓋的塑料管的含10~50 μg poly（A）⁺ RNA的0.3 ml 雜交液在70℃預(yù)熱10 min。

13.  然后將10片小濾膜放入雜交液中，在50℃溫育2 h。

14.  將小濾膜轉(zhuǎn)移到50 ml 的試管（每管zui多可裝20片膜）中，每次用225 ml TES/0.5%SDS冼液于65℃旋轉(zhuǎn)振蕩洗滌30 s，共10次，吸去上請(qǐng)。

15.  然后每次用25 ml TES液干65℃洗膜，共2次。

16.  將每片小濾膜分別轉(zhuǎn)移到無(wú)菌、硅化的1.5 ml 微量離心管中，每管加入0.3 ml 水、2 μl 10 mg/ml 的酵母tRNA。

17.  置沸水浴中變性60 s，立即置干冰或冷乙醇中速凍。 接著在室溫下解凍。

 

18.  用無(wú)菌針挑去濾膜，往每個(gè)微量離心管中加入150 μl 飽和酚和150 氯仿/異戊醇，混勻，離心后將水相轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的微量離心管中。

19.  加入30 μl 3 mol/l 乙酸鈉和2 倍體積的無(wú)水乙醇，離心沉淀核酸15 min，用0.5 ml 乙醇洗滌一次后凍干。

20.  將此雜交選擇的RNA重懸于10 μl 水中。

21.  取5 μl 雜交選擇的RNA，加入10 μl 翻譯反應(yīng)混合物，其中含標(biāo)記的甲硫氨酸， 30℃溫育60 min。

 

22.  加入15 μl 免疫沉淀緩沖液和1 μl 未經(jīng)免疫的血清，室溫下溫育10 min。

23.  加入40 μl 蛋白質(zhì)A-Sepharose懸液，在室溫靜置30 min、離心2 min 后將上清移至另一個(gè)新的微量離心管中。

24.  加入1 μl 針對(duì)相關(guān)基因產(chǎn)物的多克隆抗體或單克隆抗體，于室溫下溫育10 min。