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實(shí)驗(yàn)試劑

樣品提取液（8M尿素、2％非離子型去污劑NP－40、2％Ampholin，pH3.5-10、2％DTT）

膠母液 （30％的29/1的Acr/Bis），兩性電解質(zhì)

陽(yáng)極緩沖液 1M磷酸

陰極緩沖液 1M氫氧化鈉

固定液（10％的三氯、1％的磺基水楊酸）

染色液（35％乙醇、10％冰醋酸、0.15%考馬氏亮藍(lán)R250）

脫色液（35％乙醇、10％冰醋酸）

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

高壓電泳儀、IEF槽、離心機(jī)等

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 樣品提取

   1) 1ml原核表達(dá)細(xì)胞液離心取沉淀

   2) 沉淀用100ulIEF樣品緩沖液裂解，離心取上清

2. 制膠

   1) 安裝超薄膠裝置

   2) 依次加入下述試劑

            膠母液             2ml

            尿素               8M    /脫氣

            NP－40            0.2ml

            兩性電解質(zhì)         2ml

            10%過(guò)硫酸胺       50ul

            TEMED             5ul

   3) 倒膠

3. 電泳

   1) 預(yù)電泳膠凝固后，拆卸制膠裝置，將膠連同支持膜一起置于水平電泳槽上（要求，電泳槽面板上首先被液體石蠟浸潤(rùn)，在凝膠支持膜與電泳槽面板間無(wú)氣泡）。

   2) 將分別被陰陽(yáng)極緩沖液浸潤(rùn)的電極條置于膠面上將與陰陽(yáng)電極接觸的部位，蓋上電泳槽罩子，連通電源，200V預(yù)電泳10min。

   3) 電泳，將薄棉紙剪成小塊，輕輕置于預(yù)備點(diǎn)樣的膠面上，取10－15ul樣品液，點(diǎn)于薄棉紙上，蓋上罩子，連通電源進(jìn)行電泳

   4) 電泳參數(shù)

    200V 30min，400V 30min，800V4hr

4. 染色

   1) 固定，將電泳完的膠連同支持膜放置于固定液中，10min.

   2) 顯色，50℃下，將膠與支持膜放置于染色液中，顯色，直至條帶出現(xiàn)。