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DNA專題：DNA純化實驗
更新時間：2013-07-22 瀏覽次數：1748
| 實驗方法原理 | 本試劑盒適合從各種瓊脂糖凝膠中提取多至 8 μg DNA（70 bp-10 Kb），回收率為 60-85%。瓊脂糖凝膠在溫和的緩沖液（DE-A 溶液）中溶解，其中的保護劑能防止線狀 DNA 在高溫下降解，然后在 DE-B 溶液的作用下使 DNA 選擇性結合到膜上。純化的 DNA 純度高，并保持片斷完整性和高生物活性，可直接用于連接、體外轉錄、PCR 擴增、測序、微注射等分子生物學實驗。 |
|---|---|
| 實驗材料 | PCR產物 單鏈DNA 質粒DNA |
| 試劑、試劑盒 | DNA凝膠回收試劑盒 |
| 儀器、耗材 | DNA 制備管 離心管 |
| 實驗步驟 | 一、試劑盒組成、貯存、穩(wěn)定性 1. 說明書，耗材：DNA 制備管、2 ml 離心管、1.5 ml 離心管。 2. Buffer DE-A：凝膠熔化劑，含 DNA 保護劑，防止 DNA 在高溫下降解。室溫密閉貯存。 3. Buffer DE-B：結合液（促使大于 70 bp 的 DNA 片段選擇性結合到 DNA 制備膜上）。室溫密閉貯存。若出現沉淀，應于 70°C 溫育溶解并冷卻至室溫后再使用。 4. Buffer W1：洗滌液，室溫密閉貯存。 5. Buffer W2 concentrate：去鹽液，使用前，根據瓶上數量加入乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存?？捎?/a> 100%無水乙醇或 95%乙醇。 6. Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室溫密閉貯存。 二、實驗準備 1. *次使用前，Buffer W2 concentrate中加入體積的無水乙醇。 2. 準備無核酸和核酸酶污染的Tip頭、離心管。 3. 準備75°C水浴。 三、操作步驟 1. 在紫外燈下切下含有目的 DNA 的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎。計算凝膠重量（提前記錄 1.5 ml 離心管重量），該重量作為一個凝膠體積（如 100 mg = 100 μl 體積）。 2. 加入 3 個凝膠體積的 Buffer DE-A，混合均勻后于 75°C 加熱（低熔點瓊脂糖凝膠于 40°C 加熱），間斷混合（每 2-3 min），直至凝膠塊*熔化（約 6-8 min）。 3. 加 0.5 個 Buffer DE-A 體積的 Buffer DE-B，混合均勻；當分離的 DNA 片段小于 400 bp 時，加入 1個凝膠體積的異丙醇。 步驟 4-6 可以選擇負壓法或離心法。 A. 負壓法 4A. 正確連接負壓裝置，將 DNA 制備管插到負壓裝置的插口上。吸取步驟 3 中的混合液，轉移到制備管中，開啟并調節(jié)負壓至-20-30 英寸汞柱，緩慢吸走管中溶液。 . 加 0.5 ml Buffer W1，吸盡管中溶液。 6A. 加 0.7 ml Buffer W2，吸盡管中溶液。以同樣的方法再用 0.7 ml Buffer W2 洗滌一次。 * 確認在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。 B. 離心法 4B. 吸取 3 中的混合液，轉移到 DNA 制備管（置于 2 ml 離心管）中，12 000×g 離心 1 min。棄濾液。 5B. 將制備管置回離心管，加 0.5 ml Buffer W1，12 000×g 離心 30 s，棄濾液。 6B. 將制備管置回離心管，加 0.7 ml Buffer W2，12 000×g 離心 30 s，棄濾液。（可選步驟）以同樣的方法再用 0.7 ml Buffer W2 洗滌一次 12,000×g 離心 1 min。 * 確認在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無水乙醇。 7. 將制備管置于 2 ml 離心管中，12 000×g 離心 1 min。 8. 將制備管置于潔凈的 1.5 ml 離心管中，在 DNA 制備膜正中央加 25-30 μl 水或 Eluent，室溫靜置1 min。12 000×g 離心 1 min 洗脫 DNA。 |
| 注意事項 | 1. 在步驟 1 中，將凝膠切成細小的碎塊可大大縮短凝膠熔化時間（線型 DNA 長時間暴露在高溫條件下易于水解），從而提高回收率。勿將含 DNA 的凝膠長時間地暴露在紫外燈下，減少紫外線對 DNA造成的損傷。 2. 在步驟 2 中凝膠必須*熔化，否則將嚴重影響 DNA 回收率。 3. 將 Eluent 或水加熱至 65°C，有利于提高洗脫效率。 4. DNA 分子呈酸性，建議在 2.5 mM Tris-HCl |
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