一、細(xì)胞總RNA提取

1.  收集約5×10⁷個細(xì)胞，冷PBS洗滌。

2.  加入400 ul RNA提取液（含6 mol/l 的異硫氰酸肽，0.5%十二烷基肌酸鈉，0.025 mol/l 構(gòu)櫞酸鈉pH7.0，0.25 mol/l 乙酸鈉，pH4.0，0.5%二疏基乙醇，50%萘酸），混勻。

3.  加入400 ul 氯仿，混勻，以13 000 r/min 于4℃離心15 min。

4.  取上清液加入等體積的異丙醇，4℃放置30 min。

5.  然后以13 000 r/min 離心15 min，吸上清，將RNA成點用75%的乙醇洗滌1次，溶于100 ul 的無菌雙蒸餾水中。

6.  并用紫外分光光度計檢測RNA純度（A₂₆₀/A₂₈₀應(yīng)為1.8~2.0）后備用。

二、反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增

1.  引物
 

2.  取細(xì)胞總RNA10 ul 加入20 ul AMV逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系中，42℃保溫30 min 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

3.  然后置95℃，3 min 終止反轉(zhuǎn)錄。

4.  接著在Taq酶的作用下，用mdr-1和β₂-MG引物，對cDNA上的目的片段進(jìn)行PCR

5.  94℃預(yù)變性2 min，然后94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，擴(kuò)增35個循環(huán)。

6.  zui終在60℃保溫7 min，以保證產(chǎn)物充分延伸。

7.  取10 ul 擴(kuò)增產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下照相，與mdr-1 cDNA陽性對照，等位的DNA條帶為陽性，反之為陰性。